防辐射服评测原代细胞培养
细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法。
取材的基本要求：
(1)取材要注意新鲜和保鲜，新鲜组织应在4~6h内制成细胞，进入培养箱。
(2)取材应严格无菌，将所取组织在含有高浓度抗生素内4℃下存放2h，再用PBS洗2~3次，所用器皿应事先消毒。
(3)取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤。
(4)要仔细取出所需材料的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
(5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。
(6)原代细胞取材时要同时保留组织学标本和电镜标本，做好详细的记录，以备之后查询。
原代细胞与细胞系有什么区别？
根据传统定义，自组织第一次收获和接种的细胞被称为原代细胞 。这类细胞直接从组织分离，生命周期有限，经数次传代后会逐渐停止生长。原代细胞在有限的生命周期内需掌握好细胞的最大生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。
细胞系是不断生长、分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。
但实际上，经过长时间、连续的传代培养后，细胞系随着代数的增加，细胞的基因型和表型都有可能发生改变。
需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群，除非细胞经过了遗传改造。
倍增和代数有什么区别？
倍增是培养物中细胞总数的翻倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的，是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。
冻存的细胞该如何开始培养？
(1)将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。
(2)将冻存管快速的放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体完全融化。
(3)将冻存管立即从水浴中拿出，擦干，离心，1000rpm，5min。
(4)小心吸去冻存液，加入1ml新鲜培养液，轻轻吹打混匀细胞，细胞计数。
(5)将计数后的细胞悬液加入倍数体积的培养基，混匀后加到新的培养皿中，十字摇晃法混匀细胞。
(6)将培养皿放入培养箱中（37℃，5%CO2，95%空气），2-3天全量换液。
常见问题的原因及其解决的办法
一、培养液pH值变化太快可能原因：
(1)CO2张力不对；
(2)培养瓶盖拧得太紧；
(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足；
(4)培养液中盐浓度不正确；
(5)细菌、酵母或真菌污染；
建议解决方法：
(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2的培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
二、培养液出现沉淀，但pH值不变，可能原因：
(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来；
(2)冰冻保存培养液；
建议解决方法：
(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
三、培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因：
细菌或真菌污染；
建议解决方法：
丢弃培养物，或用抗生素除菌。
四、原代细胞培养物污染的原因：
原代培养组织在进入培养前已污染；
建议解决方法：
培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。
五、培养细胞不贴壁的原因：
(1)胰蛋白酶消化过度；
(2)支原体污染；
(3)培养液中无贴壁因子；
建议解决方法：
(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
(3)清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
六、培养细胞生长减慢可能原因：
(1)由于更换不同培养液或血清；
(2)培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；
(3)培养物中有少量细菌或真菌污染；
(4)试剂保存不当；
(5)接种细胞起始浓度太低；
建议解决方法：
(1)让细胞逐渐适应新培养液。
(2)换入新鲜配制培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子。
(3)用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。
(4)血清需保存在-5℃到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完。
(5)增加接种细胞起始浓度。
七、培养细胞死亡可能原因：
(1)培养箱内无CO2；
(2)培养箱内温度波动太大；
(3)细胞冻存或复苏过程中损伤；
(4)培养液渗透压不正确；
(5)培养液有毒代谢产物堆积；
建议解决方法：
(1)检测培养箱内CO2。
(2)检查培养箱内温度。
(3)取新的保存细胞种。
(4)检测培养液渗透压。
注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260– 350mOsm/kg。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗透压。
(5)换入新鲜培养液。
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said：
小知
上海卓知生物聚焦蛋白质相关研究和检测，提供包括细胞生物学、动物实验及蛋白和基因检测等方面的技术服务、科研策略、研究方法、科研数据统计分析、成果表达等方面的服务。
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