防辐射服评测丁二酸二甲酯
研究背景：
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)约占成人恶性淋巴瘤的30%-40%，具有侵袭性的临床过程。采用标准的一线多药化疗，大约2/3的患者表现出持久的反应，而其余的患者要么对一线治疗无效，要么在初步反应后复发。虽然DLBCL构成了一个临床上不同的群体，但基因表达谱导致了两个主要的亚型的确定。生发中心B细胞样细胞(GCB)和活化的B细胞样(ABC)DLBCL ，而突变，例如CD79，CARD11，MYD88或TNFAIP3，导致组成性NF-κB的激活在ABC DLBCL亚型中富集，GCB DLBCL经常包含基因的改变，如EZH2型，CREBBP或SGK1，以及bcl2易位。铁死亡是一种非凋亡性的细胞死亡形式，其特征是磷脂过氧化产物的积累和包括线粒体在内的细胞形态的特殊变化。janus激酶(Jaks)介导STAT3的激活，使其酪氨酸残基磷酸化，导致其二聚化、核转位、dna结合，最终导致促生存靶基因的表达。因此，铁螯合剂，如去铁胺(DFX)，可以在实验中使用一定浓度来削弱铁死亡。除了依赖铁的脂质自氧化之外，在白三烯生物合成过程中催化多不饱和脂肪酸过氧化的脂氧合酶(LOXs)可能调节铁死亡的易感性，尽管它们在铁死亡中的确切作用仍在争论中。脂质过氧化物可以通过谷胱甘肽(GSH)消耗的方式被硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)解毒，Gpx4是唯一能够减少脂质过氧化的酶。即使Gpx4被抑制，脂溶性抗氧化剂，如铁抑素-1(Fer-1)或α-生育酚，也可以防止脂质过氧化，从而防止铁死亡的诱导。富马酸二甲酯(Dmf)是fda批准的用于治疗复发缓解型多发性硬化症的一线药物。在分子水平上，亲水性DMF的有益药理作用还不是很清楚，但已经提出了几种作用模式。一方面，DMF被认为通过激活核因子红系2相关因子2(NRF2)途径发挥神经保护作用，该通路促进几种抗氧化蛋白的表达，从而保护损伤和炎症过程中产生的活性氧(ROS)。另一方面，DMF与参与氧化还原调节、糖酵解、NF-κB和HIF-1α信号的多种蛋白的可及性半胱氨酸直接和不可逆地反应。DMF在抑制ABC DLBCL中NF-κB和JAK/STAT3生存信号的同时，有效地诱导了GCB DLBCL细胞的铁链细胞死亡。DMF与铁死亡抑制蛋白1抑制剂或BH3类似物联合应用可协同诱导DLBCL细胞死亡，提示DMF在治疗DLBCL方面具有广阔的应用前景。
研究内容：
DMF治疗对DLBCL生长的影响。由于DMF已被证明可以抑制多发性硬化症或牛皮癣患者的淋巴细胞活化和增殖，作者测试了它对各种人类淋巴瘤细胞系生长的潜在损害作用。值得注意的是，用20μM的DMF处理大多数DLBCL细胞系的存活率显著降低(图1A-B)。DMF处理对两种主要的DLBCL亚型，GCB DLBCL都有细胞毒性作用(图1A）和ABC DLBCL(图1B)。而套细胞淋巴瘤(MCL)细胞株对DMF。20μM DMF处理不影响淋巴瘤/白血病患者的髓系细胞系和各种肿瘤/黑色素瘤细胞系的生长(图1C)。这些结果表明，B细胞淋巴瘤，如DLBCL和MCL，表现出更高的DMF敏感性。
二甲基甲酰胺诱导DLBCL铁死亡。为了深入了解DMF依赖的DLBCL细胞毒性的分子机制，作者研究了DMF的亲电性对其抗淋巴瘤活性的重要性。事实上，结构类似物琥珀酸二甲酯(DMS)缺乏DMF的亲电碳-碳双键，不能损害DLBCL细胞系的生长。同样，DMF代谢物富马酸单甲酯(MMF)被认为是羟基羧酸受体2(HCA2)的有效激动剂，对DLBCL细胞的存活没有影响。相反，亲水性衣康酸二甲酯(DI)抑制GCB和ABC DLBCL细胞系的生长，当施加的浓度与20μM 11 DMF(Suppl)诱导的Nrf2稳定程度相似时。接下来，作者评估了DMF消耗还原型谷胱甘肽(GSH)的能力，还原型谷胱甘肽(GSH)是一种主要的细胞抗氧化剂。有趣的是，作者注意到GCB DLBCL的平均GSH水平低于ABC DLBCL细胞系，而且DMF非常有效地减少了GSH池，特别是在GCB DLBCL细胞系中(图2A-B)。与公认的谷胱甘肽合成抑制剂γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫氨酸亚砜和胱氨酸-谷氨酸逆向转运体(系统XC-)抑制剂erastin相似，二甲基甲酰胺处理会导致谷胱甘肽池(Suppl.)迅速耗尽，而谷胱甘肽-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂(BsO)和胱氨酸-谷氨酸逆向转运体(系统XC-)抑制剂erastin对谷胱甘肽合成的抑制作用不明显。Gpx4对过氧化脂质的解毒非常需要还原型谷胱甘肽。因此，作者使用氧化敏感的亲脂探针BODIPY C11对几种经DMF处理的DLBCL细胞系中的脂质过氧化进行了定量。值得注意的是，低剂量的DMF已经足以在GCB DLBCL细胞系中诱导大量的脂质过氧化，而在ABC DLBCL细胞中诱导脂质过氧化需要较高的DMF浓度(图2C)。此外，各种MCL细胞系在DMF处理后也表现出强烈的脂质过氧化反应，而在髓系细胞系DMF中，GSH水平仅略有降低，未能诱导脂质过氧化。由于脂质过氧化是一种称为铁死亡的非凋亡性细胞死亡的标志，作者评估了铁螯合剂(去铁胺；DFX)和亲脂性抗氧化剂(α-生育酚和铁抑素-1；FER-1)对二甲基甲酰胺诱导的脂质过氧化和细胞死亡的影响。与Gpx4抑制剂RSL3类似，二甲基甲酰胺可引起较强的脂质过氧化反应，与Fer-1、DFX或α-生育酚。在DMF剂量为20μM时，Fer-1可阻止GCB细胞死亡，但不能阻止ABC DLBCL细胞系的细胞死亡，这表明GCB亚型对依赖DMF的12铁下垂特别敏感(图2D-E)。此外，铁死亡抑制剂DFX、N-乙酰-L-半胱氨酸和α-生育酚可保护GCB DLBCL细胞免受二甲基甲酰胺诱导的毒性，但广谱caspase抑制剂Q-VD不能保护GCB DLBCL细胞免受DMF诱导的毒性(图2F)。为了理解为什么ABC DLBCL细胞比GCB DLBCL细胞更不容易受到DMF诱导的铁链细胞死亡的影响，作者研究了转录因子NF-κB的潜在参与，NF-κB在ABC DLBCL 41中显著地被结构性激活，在两个GCB DLBCL细胞系中过表达NF-DLBCL B成员RelA在DMF处理后部分降低了脂质过氧化和细胞毒性(图2G-I)。这可能是由于NF-κB介导的多种抗氧化蛋白的诱导，如硫氧还蛋白、NAD(P)H脱氢酶[醌]1、血红素加氧酶-1、锰超氧化物歧化酶和铁蛋白重链。综上所述，作者可以证明DMF处理有效地耗尽了GCB DLBCL细胞中本已很低的谷胱甘肽水平，并诱导了脂质过氧化，导致铁眼症细胞死亡。
GCBDLBCL中5-LOX的高表达与铁死亡易感性相关。为了进一步了解GCB DLBCL对DMF诱导的铁死亡易感性增加的分子基础，作者筛选了在两种主要的DLBCL亚型中差异表达的铁死亡相关基因。虽然作者没有检测到长链脂肪酸辅酶连接酶4(ACSL4)、铁死亡抑制蛋白1(FSP1)或系统XC亚单位SLC7A11的表达有任何差异，但ABC DLBCL细胞株与其GCB对应物相比显示出Gpx4水平的升高(图3A)。然而，DLBCL亚型之间最显著的区别是ALOX5基因，它编码花生四烯酸5-脂氧合酶(5-LOX)(图3A，B)。人DLBCL活检的免疫组织化学结果显示，5-LOX在核周/核中呈强阳性染色，染色强度约为5-LOX。50%的GCB DLBCL。相反，反应性淋巴结的生发中心B细胞中没有5-LOX的核定位，仅在ABC DLBCL活检中很少观察到5-LOX的核定位(图3C-D)。与人的活检组织相似，在GCB DLBCL细胞系(Suppl)中也检测到核5-LOX。为了阐明在DLBCL中观察到的不同ALOX5表达模式背后的分子基础，作者调查了ALOX5启动子转录起始点周围富含GC区域的DNA甲基化状态，其中还包括转录因子Sp1.45的结合位点，但作者没有检测到DLBCL亚型之间甲基化状态的差异。相反，五分之三的GCB DLBCL细胞株在Sp1抑制剂mithramycin A。由于到目前为止还没有证据表明DLBCL亚型之间Sp1活性存在差异，作者研究了在ABC DLBCL中失控的Bcell受体(BCR)信号是否会影响5-LOX的表达。事实上，用Src、Btk、Syk和PKC抑制剂或CD79A沉默抑制ABC DLBCL中慢性激活的bcr信号，不仅降低了NF-κB靶基因TNFAIP3的表达，而且显著增加了ALOX5的水平(图3E)。相反，通过BCR交联或佛波酯12-肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和离子霉素刺激GCB DLBCL细胞，可增加TNFAIP3的表达，但降低ALOX5的表达(图3F)，提示慢性激活的BCR信号参与抑制ABC DLBCL中5-LOX的表达。
5-LOX促进DMF诱导的铁死亡。为了探讨5-LOX在DMF诱导的铁死亡中的重要性，作者用LOX抑制剂去甲二氢愈创木酸(NDGA)或5-LOX特异性抑制剂齐留通(Zileuton)抑制其活性。NDGA和齐留通均能有效地保护GCB DLBCL细胞免受DMF诱导的脂质过氧化和细胞毒性。出人意料的是，shRNA介导的5-LOX表达沉默只略微减轻了DMF诱导的毒性，表明NDGA和齐留通的抗氧化特性而不是LOX抑制介导了它们对DMF的保护作用。与缺乏这种自由基捕捉活性的5-脂氧合酶抑制剂(即CJ-13610和CAY10649)或靶向5-脂氧合酶激活蛋白的抑制剂(即MK-886)联合治疗可部分但不完全地从DMF介导的细胞毒性中解救出来(图3G)。有趣的是，ALOX5沉默增加了DLBCL细胞中谷胱甘肽的相对含量，降低了DMF诱导的脂质过氧化(图3H)。此外，在DMF重复处理中存活的细胞显示5-LOX蛋白表达减少，这表明尽管5-LOX对DMF诱导的铁死亡不是必需的，但它可能有助于细胞内的一般氧化环境，从而增加铁死亡的敏感性。HT细胞系是为数不多的缺乏5-LOX表达的GCB DLBCL细胞系之一，表现出相当高的GSH水平，并且对DMF诱导的脂质过氧化和细胞毒性都具有抵抗力(图3A-B)。标记FLAG的5-LOX在HT细胞中的强制表达促进了DMF诱导的脂质过氧化，表明5LOX在GCB DLBCL中的表达对DMF介导的铁死亡。综上所述，GCB DLBCL中5-LOX的高表达与其对DMF诱导的铁死亡的敏感性有关。
二甲基甲酰胺通过抑制IKK复合体降低NF-κB活性。与GCB DLBCL不同，低剂量的DMF不能在ABC DLBCL细胞系中诱导铁死亡（图2D-E)。为了阐明其在ABC DLBCL中抗淋巴瘤作用的分子机制，作者用RNA-seq定量了DMF诱导的HBL-1细胞整体基因表达谱的变化(图4A)。基因集富集分析发现，几个NF-κB基因信号在二甲基甲酰胺处理后下调，包括经典的NF-κB靶基因，如NFKBIA、NFKBIZ、TNFAIP3、BIRC3和CFLAR(图4A-C)。为了揭示ABC DLBCL中依赖DMF的NF-κB抑制的分子基础，作者评估了IKK复合体的功能，IKK复合体是规范的NF-κB信号转导中的一个重要参与者。二甲基甲酰胺处理削弱了IκBα在S32/36的磷酸化，表明二甲基甲酰胺破坏了ABC DLBCL中IKK复合体的慢性激活(图4D)。与IκBα已确立的抑制作用一致，DMF处理导致relA转位显著减少，并使relA和c-rel与它们共同的dna序列的结合受损(图4E)。由于许多在DMF处理后上调的基因代表了经典的Nrf2靶基因(如gclm、TXNRD1、NQO1、SLC7A11和FTH1)，作者探索了Nrf2在依赖DMF的NF-κB抑制中的潜在作用(图4A)。然而，NRF2沉默不影响IKK活性的抑制和DMF诱导的细胞毒作用，说明DMF介导的NF-κB抑制和细胞死亡不依赖于NRF2。因此，即使用DMF代谢物MMF处理ABC DLBCL细胞系引起NRF2反应，它也不能损害I-κB-α磷酸化。由于Gpx4抑制剂RSL3、Bso和erastin耗尽细胞内的谷胱甘肽池并诱导细胞内的促氧化状态，也不能抑制ABC DLBCL中IKK16的活性，因此作者得出结论：蛋白质或脂质氧化不参与DMF介导的NF-κB信号转导的抑制。此外，二甲基甲酰胺处理不影响BLNK、PLCγ2、ERK1/2、AKT、JNK1/2和p38的磷酸化，因此不影响上游的bcr和MAPK信号转导。BcR介导的NF-κB的激活在很大程度上依赖于CARD11-Bcl10-MALT1(CBM)复合物的组装，它在多泛素化时不仅招募并激活IKK复合物，而且促进MALT1蛋白酶的激活，进而通过切割和失活负调控因子(如A20或RelB)来支持NF-κB信号转导。无论是K63连接的Bcl10的多泛素化还是MALT1介导的RelB裂解都不受K63连接的Bcl10的多泛素化和MALT1介导的RelB裂解的影响。为了研究IKK2是否被DMF直接修饰，用生物素偶联的碘乙酰胺(IA-Biotin)标记含有反应性半胱氨酸的蛋白质，并用链霉亲和素小球分离。在溶剂处理的细胞中，IKK2由于其活性半胱氨酸残基容易被沉淀。然而，DMF标记前的处理显著减少了碘乙酰胺探针与IKK2和Keap1的反应，后者是氧化和亲电应激的关键传感器，含有几个反应性半胱氨酸残基(图4G)。对DMF处理的ABC DLBCL细胞内源性IKK复合物的质谱分析表明，几个半胱氨酸残基发生了琥珀酸化，例如IKK2的激酶结构域上的C179和亮氨酸拉链结构域上的C464以及C347。有趣的是，被DMF琥珀酸化的半胱氨酸在不同物种中高度保守。为了评估C179和C464在DMF依赖的IKK2抑制中的重要性，作者评估了IKK2到17的半胱氨酸到丙氨酸突变体催化IκBα磷酸化的能力。正如以前报道的，IKK2C179A突变体表现出激酶活性受损，而IKK2C464A的活性与野生型蛋白相似。引人注目的是，尽管野生型IKK2和IKK2C464A突变体的激酶活性被DMF处理降低，但IKK2C179A突变体的剩余活性对DMF具有抗性，这表明这种半胱氨酸残基的琥珀酸化是观察到DMF介导的IKK2抑制的关键(图4H）。总体而言，DMF不改变ABC DLBCL的上游bcr信号或CBM复合体的形成，但通过抑制IKK活性而削弱NF-κB信号。
Janus激酶被DMF直接抑制。除了κBα磷酸化之外，DMF处理同时降低了在ABC DLBCL细胞系中观察到的STAT3组成型磷酸化，表明DMF在STAT3抑制中的直接作用(图5A)。二甲基甲酰胺治疗还严重损害了由外源性白介素-6或白介素-10激活的碱性成纤维细胞生长因子相关凋亡配体细胞株中STAT3的磷酸化(图5B)。与IKK抑制类似，MMF、二甲基硫、BSO、伊拉斯汀和氯化亚锡都不影响STAT3磷酸化状态。由于作者注意到稳态和干扰素α诱导的STAT1磷酸化也受到二甲基甲酰胺处理的损害，作者假设二甲基甲酰胺可能直接抑制骏利激酶的活性(图5A，C)。事实上，二甲基甲酰胺处理降低了未处理或干扰素α刺激的碱性成纤维细胞生长因子相关凋亡配体细胞株中JAK1和TYK2的自磷酸化(图5D)。引人注目的是，所有研究的骏利激酶在二甲基甲酰胺处理后都显示出用吲哚乙酸-生物素标记减少，表明二甲基甲酰胺介导了这些激酶的琥珀酰化(图5E)。为了确定哪些半胱氨酸残基被二甲基甲酰胺修饰，作者从经溶剂或二甲基甲酰胺处理的ABC DLBCL细胞中免疫沉淀JAK1，并通过质谱分析潜在的琥珀酰化事件。仅在经二甲基甲酰胺处理的样品中检测到JAK1两个半胱氨酸残基的琥珀酰化(即C257和C731)(图5F)。虽然C731位于无催化活性的蛋白激酶1结构域，但作者假设FERM结构域内高度保守的C257的琥珀酰化(介导与细胞因子受体的相互作用)可能是观察到的二甲基甲酰胺对JAK1活性的抑制作用的原因(图5F)。结构分析证实了C257的可及性，从而证实了二甲基甲酰胺直接修饰JAK1的想法(图5G)。引人注目的是，二甲基甲酰胺处理确实削弱了白介素-10受体α亚单位(IL10RA)与野生型JAK1的相互作用，但没有削弱与JAK1C257A突变体的相互作用(图5H)。由于JAK1C257A突变体的活性仍然部分受到二甲基甲酰胺处理的损害，JAK1的进一步修饰可能有助于二甲基甲酰胺介导的JAK/STAT途径的抑制。转导HBL-1细胞以表达高活性STAT3突变体(STAT3C)，并用外源性IL-6/IL-10处理，显示出对二甲基甲酰胺介导的细胞毒性的抗性增加，证实了JAK抑制对二甲基甲酰胺介导的毒性的重要性(图5I)。总的来说，作者的数据表明二甲基甲酰胺对骏利激酶的直接修饰和抑制是其在ABC DLBCL中毒性的重要机制。
抑制卵泡刺激素1和BCL-2协同二甲基甲酰胺处理。为了研究二甲基甲酰胺在体内的治疗潜力，作者将人DLBCL细胞系移植到斑马鱼胚胎中，随后在溶剂或二甲基甲酰胺补充培养基中孵育。5 M二甲基甲酰胺的剂量足以在超过50% (SU-DHL-6)或70% (DOHH2)的动物中防止肿瘤形成(图6A-B)。为了进一步提高DLBCL细胞对铁死亡细胞死亡的敏感性，作者在药理学上靶向谷胱甘肽非依赖性铁死亡抑制蛋白1(FSP 1)。引人注目的是，用DMF和iFSP1联合治疗协同诱导GCB DLBCL细胞系的细胞毒性(图6C)。此外，BCL-2抑制剂ABT-199，但无论是PI3K抑制剂AZD8835还是微管蛋白聚合抑制剂长春新碱，都显示出与DMF治疗在ABC DLBCL细胞中有希望的组合效果(图6D)。为了在体内验证二甲基甲酰胺和ABT-199联合治疗的有效性，作者使用了HBL-1和患者衍生的(VFN-D1)异种移植小鼠模型。虽然二甲基甲酰胺单独治疗足以显著减少肿瘤生长，但与ABT-199联合使用可显著增强其抗淋巴瘤效果(图6E-F)。总之，作者的数据揭示了二甲基甲酰胺在体外和体内的强大抗肿瘤活性，并表明用FSP1抑制剂或BH3模拟物联合治疗二甲基甲酰胺可能是一种有前途的DLBCL治疗新策略。
结论：
在这项研究中，作者证明了二甲基甲酰胺对两种主要的DLBCL亚型的强有力的抗淋巴瘤作用。二甲基甲酰胺抑制碱性成纤维细胞生长因子相关凋亡配体中的核因子-κB和JAK/STAT3存活信号，有效诱导碱性成纤维细胞生长因子相关凋亡配体相关凋亡配体细胞凋亡。二甲基甲酰胺与铁调抑制蛋白1抑制剂或BH3模拟物的联合治疗协同诱导了DLBCL细胞的细胞死亡，突出了二甲基甲酰胺在治疗这种恶性肿瘤中有希望的治疗潜力。
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